一、動(dòng)物相關(guān)信息

1. 動(dòng)物品種：SD 大鼠
2. 動(dòng)物性別：雄性

3. 動(dòng)物周齡及體重：體重處于 250 - 300g 范圍

   
   

二、造模方法

1. 前期準(zhǔn)備：先對大鼠實(shí)施麻醉、消毒處理，隨后將其妥善固定。
2. 血液采集：使用經(jīng)肝素預(yù)潤的針筒抽取 0.2 ml 血液。
3. 手術(shù)操作
   • 將大鼠頭部穩(wěn)固固定在已安裝微量注射泵的腦立體定位上，于頭皮中線上切開一個(gè) 2cm 的矢狀切口。
   • 精確在前鹵 0.1mm、右側(cè) 4 mm 處做好鉆孔標(biāo)記，保證孔洞位于冠狀縫位置。
   • 運(yùn)用鉆頭在標(biāo)記處垂直鉆孔，操作過程務(wù)必注意避免損傷硬膜。之后把 0.2 ml 未肝素化的血液裝入針筒，將針的斜面放置在與中線相反方向，把針尖插入腦組織直至針尖完全消失。
   • 使針垂直插入右側(cè)尾狀核 5.5 mm 處，以 10 μl/min 的速度將 100 μl 自體全血緩慢灌入右側(cè)基底節(jié)區(qū)。灌注結(jié)束后，針頭繼續(xù)留置 2 min。

   • 緩慢拔出針，用骨蠟填抹鉆孔處，隨后縫合皮膚。

     
     

三、成模鑒定

1. 一般情況觀察：密切留意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的日常表現(xiàn)。
2. 特定試驗(yàn)檢測
   • 放置測試：通過該測試對大鼠相關(guān)能力進(jìn)行評估。
   • 轉(zhuǎn)角試驗(yàn)：以此試驗(yàn)獲取大鼠行為學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)。
3. 生理指標(biāo)檢測
   • 腦水容量檢測：鑒于腦水腫與腦出血患者的生存率關(guān)聯(lián)緊密，需檢測腦水腫的形成情況。主要采用干濕重法對腦水容量進(jìn)行測定。
   • 血腦屏障通透性檢測：常用的檢測手段有熒光同位素法、伊文思藍(lán)（Evans blue）染色法，此外，利用 DAB 染色法做 IgG 染色同樣能夠檢測血腦屏障的通透性。
   • 腦基因組學(xué)分析：旨在明確基因表達(dá)的改變情況。

   • 組織學(xué)評估：全面評估出血量、出血位置、出血范圍，以及神經(jīng)細(xì)胞死亡狀況和腦萎縮情況。

     
     

四、后續(xù)檢測指標(biāo)建議

1. 腦水容量：采用干濕重法檢測腦水腫形成情況，因腦水腫對腦出血患者生存率影響重大。
2. 血腦屏障通透性：運(yùn)用熒光同位素、伊文思藍(lán)（Evans blue）染色、DAB 染色法做 IgG 染色等方法進(jìn)行檢測。
3. 腦基因組學(xué)：確定基因表達(dá)的變化情況。
4. 組織學(xué)：評估出血量、出血位置、范圍、神經(jīng)細(xì)胞死亡情況及腦萎縮情況。

5. 腦組織 HE 染色：對腦組織進(jìn)行 HE 染色分析。

   
   

五、注意事項(xiàng)

1. 飼養(yǎng)管理：造模后的大鼠需進(jìn)行單籠喂養(yǎng)，注重做好保溫工作。若在造模過程中或造模后大鼠死亡，導(dǎo)致無法收集到該組實(shí)驗(yàn)所需數(shù)據(jù)，應(yīng)按照相同隨機(jī)原則選用備用大鼠進(jìn)行替代。
2. 標(biāo)本獲取：在每組預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)（1 天、3 天、5 天），待大鼠麻醉成功后，使其呈仰臥位。沿腹部中線，先用組織剪依次剪開皮膚，再鈍性分離皮下組織，接著剪開腹部肌肉和腹膜，然后鈍性分離下腔靜脈。使用一次性靜脈采血針抽取 3ml 靜脈血，將血液在室溫下放置 2 小時(shí)后，放入離心機(jī)中，在 2 - 8 攝氏度、1000r/min 的條件下離心 15 分鐘，取上層血清分裝到防凍管中，放置于 -20°C 的冰箱內(nèi)保存，以備后續(xù)檢測使用。
3. 腦組織取材：采血完畢后，立即用止血鉗夾閉下腔靜脈及腹主動(dòng)脈，繼續(xù)沿著腹中線向上剪至劍突位置，剪開膈肌，再沿胸骨旁開 2cm 分別剪開兩側(cè)肋骨，用組織鉗提取胸骨向上固定，充分暴露心臟。將連接輸液器的注射針插入左心室尖部，快速滴注生理鹽水，同時(shí)用眼科剪剪開右心耳，持續(xù)進(jìn)行灌注，灌注速度先快后慢，直至大鼠眼球、上爪變白，且右心耳灌注液變清亮?xí)r停止灌注。迅速斷頭取腦，完整剝離腦組織，放入 4%的多聚甲醛中浸泡 48 小時(shí)，用于后續(xù)病理檢測。
4. 溫度控制：在缺血性腦損傷以及腦出血模型中，溫度的微小變化都可能產(chǎn)生影響。腦出血后大鼠自身的體溫調(diào)節(jié)功能會(huì)受到影響，實(shí)驗(yàn)后期動(dòng)物體溫可能急劇下降，這種溫度變化會(huì)干擾腦出血模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，需要采用顱骨溫控和肛門溫控措施，并且在術(shù)后 48h 內(nèi)將動(dòng)物飼養(yǎng)在溫控保溫箱中。
5. 性別因素：在缺血性卒中模型和腦出血模型中，性別對實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在影響。在缺血性卒中模型里，雌性動(dòng)物的行為分?jǐn)?shù)以及腦梗死體積相較于雄性動(dòng)物明顯減少；在腦出血模型中，雌性動(dòng)物在行為學(xué)上的恢復(fù)期更短，腦血腫也較小。雌性動(dòng)物的神經(jīng)保護(hù)作用可能與循環(huán)中的雌性激素和黃體酮有關(guān)，所以實(shí)驗(yàn)通常選擇雄性動(dòng)物。
6. 手術(shù)出血處理：手術(shù)過程中若遇到出血問題，可使用止血綿和骨蠟進(jìn)行止血。
7. 注射速度考量：與以往模型的快速注射方式不同，此模型采用慢性注射法將血液注入腦部軟組織。這種慢性注射方式不僅能夠限制血液外滲進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，更逼真地模擬自然過程，還能避免對毗鄰組織產(chǎn)生生理性壓力傷害。
8. 血液來源選擇：腦水腫是腦出血研究的關(guān)鍵內(nèi)容，腦部軟組織血腫會(huì)引發(fā)腦屏障破壞和水腫。研究表明，在自體注血 1 - 3d 后，C57BL/6 小鼠的同側(cè)基礎(chǔ)神經(jīng)節(jié)和皮質(zhì)的腦部含水量會(huì)顯著升高。而且，有研究發(fā)現(xiàn)，在腦部注血 1d 后，與自體血液相比，供體血液會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的腦部水腫。因此，可利用供體血液模型進(jìn)一步開展腦水腫相關(guān)研究。